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液滴微流控(三):液滴数字PCR

液滴微流控(三):液滴数字PCR

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什么是液滴数字PCR?

PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术是指在体外环境下,人工模拟生物体内DNA复制环境,将特定DNA片段进行大规模复制的一种技术,其操作流程如下图所示。

目前PCR技术已发展至第三代——液滴数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)。ddPCR是一种基于液滴平台的核酸分子定量技术,其将PCR与液滴微流控技术相结合,在PCR扩增前对样品进行液滴化处理,将待检样品均匀“分配”到成千上万个纳升级别的液滴,每个液滴之间相互隔离,为一个单独的反应体系,可单独完成PCR扩增,从而在短时间内便可完成DNA片段的指数级扩增。随后对液滴进行逐一分析,将液滴中含靶基因片段与不含靶基因片段的液滴分别标为1和0,再结合泊松分布,可计算出待检样品中的靶基因分子的具体个数或浓度。因此,ddPCR能实现核酸分子高灵敏、高准确、高特异性的定量,在核酸检测时展现出以下优势:

1.检测快速,有效提高检测效率。

2.有效避免假阳性和假阴性情况发生。

3.操作简单,无需专业人员操作便能完成检测。

4.不依赖标准曲线或或参照样本,直接进行靶基因分子计数,检测限可达核酸单分子。

 

ddPCR操作流程可见下图。

液滴数字PCR的应用

液滴数字PCR在基础研究,临床诊断和环境检测中有许多应用,以下举例说明:

1.定量:ddPCR能够在单分子分辨率下对目标核酸进行可重复定量,相较于荧光PCR 法(qPCR,是二代PCR技术),ddPCR进行定量不需要标准曲线,且具有更大的耐受性。

2.稀有突变检测:当生物标志物存在于高度丰富的对应物背景中,且仅存在单个核苷酸变异(single nucleotide variant,SNV)不同时,就会发生稀有突变检测。ddPCR能够在200,000倍过量的野生型背景环境下检测突变DNA,比常规qPCR灵敏度高2,000倍。

3.稀有序列检测:ddPCR可以检测HIV患者中的稀有序列,如HIV DNA,以及海洋和其他水样中粪便细菌的DNA,从而评估水质。

此外,ddPCR还可应用于液体活检、拷贝数变异分析、基因表达分析等。当然,ddPCR也可用于当下的2019新型冠状病毒(COVID-19)检测,相对于市面上的多种检测手段(如免疫法,RT-PCR法,荧光PCR法),ddPCR法可准确检测出早期感染者,实现超低浓度样本检测,展现出了巨大优势。

 

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