什么是液滴数字PCR？

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术是指在体外环境下，人工模拟生物体内DNA复制环境，将特定DNA片段进行大规模复制的一种技术，其操作流程如下图所示。

目前PCR技术已发展至第三代——液滴数字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）。ddPCR是一种基于液滴平台的核酸分子定量技术，其将PCR与液滴微流控技术相结合，在PCR扩增前对样品进行液滴化处理，将待检样品均匀“分配”到成千上万个纳升级别的液滴，每个液滴之间相互隔离，为一个单独的反应体系，可单独完成PCR扩增，从而在短时间内便可完成DNA片段的指数级扩增。随后对液滴进行逐一分析，将液滴中含靶基因片段与不含靶基因片段的液滴分别标为1和0，再结合泊松分布，可计算出待检样品中的靶基因分子的具体个数或浓度。因此，ddPCR能实现核酸分子高灵敏、高准确、高特异性的定量，在核酸检测时展现出以下优势：

1.检测快速，有效提高检测效率。

2.有效避免假阳性和假阴性情况发生。

3.操作简单，无需专业人员操作便能完成检测。

4.不依赖标准曲线或或参照样本，直接进行靶基因分子计数，检测限可达核酸单分子。

ddPCR操作流程可见下图。

液滴数字PCR的应用

液滴数字PCR在基础研究，临床诊断和环境检测中有许多应用，以下举例说明：

1.定量：ddPCR能够在单分子分辨率下对目标核酸进行可重复定量，相较于荧光PCR 法（qPCR，是二代PCR技术），ddPCR进行定量不需要标准曲线，且具有更大的耐受性。

2.稀有突变检测：当生物标志物存在于高度丰富的对应物背景中，且仅存在单个核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV）不同时，就会发生稀有突变检测。ddPCR能够在200,000倍过量的野生型背景环境下检测突变DNA，比常规qPCR灵敏度高2,000倍。

3.稀有序列检测：ddPCR可以检测HIV患者中的稀有序列，如HIV DNA，以及海洋和其他水样中粪便细菌的DNA，从而评估水质。

此外，ddPCR还可应用于液体活检、拷贝数变异分析、基因表达分析等。当然，ddPCR也可用于当下的2019新型冠状病毒（COVID-19）检测，相对于市面上的多种检测手段（如免疫法，RT-PCR法，荧光PCR法），ddPCR法可准确检测出早期感染者，实现超低浓度样本检测，展现出了巨大优势。

相关阅读：

1. 液滴微流控(一)：液滴制备方法

（https://mp.weixin.qq.com/s/FeHTXN2qVbJF2P4lD9yc0Q）

2. 液滴微流控（二）：液滴制备系统

（https://mp.weixin.qq.com/s/KqdiRJNFHzX9hNRQ9Ln3nA）