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液滴微流控(六):单细胞高通量液滴测序(Drop-seq)

液滴微流控(六):单细胞高通量液滴测序(Drop-seq)

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    细胞是生物结构与功能的基本单位,形态类型千差万别。通过细胞ji因组学,可以描述细胞特性及功能,本文所介绍的单细胞(single-cell)高通量液滴测序(Drop-seq)技术,是一种快速分析成千上万个单细胞的方法,通过将每个细胞包裹在纳升级微滴中,进行RNA杂交并生成mRNA转录物,制作细胞ji因表达谱,进一步可分析mRNA转录物的起源细胞。

 

原理简述

Drop-Seq基于液滴微流控技术,首先,将细胞悬浮液与带有分子条形码的微珠悬浮液泵至微流控芯片,汇聚并形成层流,之后再与油相汇聚,形成单分散的微滴,将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中,随后完成RNA杂交并裂解微滴,释放mRNA杂交物,完成逆转录,以PCR方式完成核酸扩增,并进行测序分析。

测序过程

1.准备材料:从组织中分离细胞,制备细胞悬浮液;制备带有分子条形码的微珠悬浮液。

 

2.制备微滴:将细胞悬浮液与微珠悬浮液泵至芯片,再与油相汇聚形成单分散的微滴,将每个细胞与一个微珠一同包裹于同一微滴中。

 

3.RNA杂交:裂解微滴中的细胞,细胞释放mRNA,与微珠上的分子条形码杂交。

 

4.逆转录:裂解微滴,释放mRNA杂交物,开始逆转录,以形成mRNA逆转录物(STAMPS)。

5. PCR扩增:在核酸外切酶的作用下,将每条mRNA逆转录物“切下”,并以PCR方式进行核酸扩增,以放大ji因信息。

 

6.测序分析:使用各种生物信息学工具进行测序分析。

为什么用液滴微流控?

 

液滴微流控将微体积样本快速分离,可实现成千上万个细胞的平行高通量分析,通常情况下,每秒可产生1000个微滴,每个微滴的体积为1nL,因此在试剂量上来讲,成本将成千倍的降低,此外,其实验过程无需用到流式荧光细胞仪等仪器,操作简单、快捷。

液滴测序芯片图解

此微流控芯片是开源的,开源链接:http://mccarrolllab.org/dropseq/

 

液滴测序系统配置

液滴测序系统主要组件:

1.三个Flow EZ压力泵或一个MFCS EZ压力泵(四通道)。

2.三个流量监测传感器。

3.一个数字高速显微镜。

4.液滴测序微流控芯片。

 

Drop-Seq,其应用远不止对细胞形态类型的识别。目前,ji因组遗传学研究正在研究识别许多导致病风险的ji因,但生物学缺乏类似液滴测序的高通量ji因识别方法,此外,将液滴测序与突变、病原体ci激等微扰动相结合,可以对多种细胞进行一个信息丰富的、维度的解读,揭示微扰动对细胞的影响。

 

参考文献:

[1]. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.

 

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